柑叶片蔗糖酶提取纯化及其性质鉴定摘要柑幼叶中存在酸性蔗糖酶。经破碎提取、热处理、硫酸铵盐析透析纯化，得其最佳条件组合为底物浓度0.8mL，酶浓度1.0mL，温度50℃，pH值3.6；最终总活力95u，回收率0.468%，比活力38u/mg，纯化倍数1.78。关键词柑叶片；蔗糖酶；纯化；性质引言蔗糖是叶片主要光合产物之一，又是植物体内物质运输的主要形式。蔗糖酶的作用是分解蔗糖，特别是酸性蔗糖酶，有人认为它对蔗糖的分解是植物细胞从蔗糖获得能量和可利用碳的主要途径[1]。人们对块根块茎类植物器官以及糖甘蔗主茎中的蔗糖酶已有很多研究[2]-[3]。有关叶组织中蔗糖酶的研究主要集中在草本植物[4]。柑是重要的果树植物，其蔗糖酶与柑果实的产量与品质是否存在相关性，有必要进行研究。本课题分离纯化了柑叶片中的蔗糖酶，并对其基本性质进行研究。材料和方法粗酶制备破碎称取10g柑叶片，剪成宽约2mm的细条。在研钵中每克鲜重加5mL0℃左右的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.0），在冰浴中研碎并提取半小时，4层纱布挤滤。滤液4℃、21000rpm冷冻离心20分钟，收集上清液并量出体积V1（样品I），留1mL上清液。热处理将上一步抽提液迅速放入50℃恒温水浴中，保温30分钟，并用玻璃棒温和搅拌抽提液，保温后迅速用冰浴冷却，两个离心管平衡后，4℃，15000rpm离心10分钟，收集上清液并量出上清液体积V2（样品Ⅱ），留1mL上清液。盐析沉淀将上一步上清液，加硫酸铵细粉达70%饱和度，在4℃冰箱中过夜，然后在4℃、13000rpm离心20分钟，收集沉淀。将沉淀溶解于10mL0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.0）中。透析将透析袋剪成10-20cm的小段，在2%(W/V)NaHCO3和1mmol/L的EDTA(pH8.0)中煮沸10min，用蒸馏水彻底洗尽透析袋，然后放在1mmol/L的EDTA(pH8.0)中煮沸10min，用蒸馏水彻底洗尽透析袋，冷却。去一段透析袋，将其一端用棉绳扎死，由开口端加入待透析的样品溶液，开口端用棉绳扎死，放入盛有0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH5.0）缓冲液的烧杯中，系于一横放在烧杯的玻璃棒上。透析过夜，中途换两次缓冲液。收集透析袋中剩余溶液（样品Ⅲ），贮存在冰箱的冰格中备用。正交试验按下表进行正交试验。表1试验安排表（样品Ⅲ酶液稀释倍数提前确定为1:10）实验号试剂(mL)2491683575%蔗糖溶液0.50.20.80.50.20.80.50.20.80.2mol/L乙酸缓冲溶液pH5.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH3.61.0pH5.61.0pH4.61.0pH4.61.0pH3.61.0pH5.61.0蒸馏水0.90.81.00.51.60.61.31.20.237℃预温5min50℃预温5...